非洲猪瘟核酸检测-实时荧光PCR法

非洲猪瘟病猪主要临床表现差异较大，不易识别，但通常有以下几种或全部典型症状，包括高热、呕吐、腹泻或便秘，有的便血，虚弱、难以站立，体表不同部位（尤其是耳、鼻、腹部、臀部）皮肤呈红色、紫色或蓝色，有的咳嗽、呼吸困难，母猪流产、产死胎或弱胎。根据其毒力，ASFV 分为三个主要类别：高毒力毒株、中等毒力毒株和低毒力毒株。ASF 的临床表现形式从特急性（非常急）到无症状（不明显）。目前我国大多数的ASFV 感染病例属于急性-亚急性。

样品类型：
——口鼻拭子
将每头猪口、鼻拭子收集于同一采样管中，以便提高检测的准确性和减少工作量。拭子装于Eppendorf 管内，建议将样品保存于4℃，立刻送检，没有实验条件的应在24 小时内送至有资质的实验室。
——全血
采血过程中应保持无菌操作。采血前，先用酒精棉对采血部位进行局部消毒。采血完毕，进行局部消毒并用干棉球按压止血。使用含有抗凝血剂（EDTA-紫色盖）的真空采血管从颈静脉、前腔静脉或耳
缘静脉抽取全血。如果动物已经死亡，可立即从心脏中采血。避免使用含肝素的真空采血管（绿色盖子）。
——血清
使用未加抗凝剂（红色盖子）的真空采血管从颈静脉、前腔静脉、耳缘静脉采血，或剖检过程收集血液样品。静置分离后，收集血清。如果血清是红色，这表明样品发生了溶血。通常已经死亡动物的血液样品易发生溶血。血清样品在分离后可以立即开展检测，如果需要储存，对于抗体检测，储存在-20℃，但是对于病毒检测，最好储存于-80℃。
——器官和组织样品
可采集脾脏、淋巴结、肝脏、扁桃体、心脏、肺和肾脏样品。脾脏和淋巴结的病毒含量最高。
对于死亡时间较长的动物，可采集骨髓样品，也可采集关节内组织液。建议将样品保持在4℃，尽快提交给实验室。如无法及时送样，可将样品储存在冷库或液氮中。样品用10%缓冲福尔马林浸泡30 分钟以上，病毒可被灭活，可用于PCR 检测。
样品的最小需求量：血清1mL；全血1mL；组织样品10g。
——环境样品
可多点采集养殖场软蜱等媒介和环境拭子，如粪便、泔水、饲料等。软蜱等媒介样品：钝缘蜱可以用于检测ASFV。有三种收集技术：手动收集、二氧化碳诱捕和真空吸引捕捉。收集后，应让蜱保持存活或直接储存在液氮中，避免DNA 降解。其它环境样品：以区块为单位，对风险等级进行区域采样。如猪场内所有墙体、地面、设备等表面进行全覆盖采样。

生产区内：包括各区间猪舍内所有区间单元墙体、地面、风机、地沟、设备、水线、料线、门、窗、湿帘、饮用水等。采样应全覆盖包括死角、料槽底部等不易采集到的位置。
生产区外：对可能的风险区域进行采样，包括地面、草坪、风机口、污水池、发酵大棚、出猪台、场区大门、料塔、下水道、员工宿舍、储物间、浴室、办公室、餐厅厨房、车辆、水源等所有可能受到污染的区域。
场周边区：猪场周围道路。

建议样品4℃以下保存。

为保证准确诊断，必须在适当温度下、以最快速度，将样品仔细包装、做好标记和相关记录，以最快路线送到最近的农业农村部指定的实验室。样品运输必须遵守农业农村部《高致病性动物病原微生物菌（毒）种运输包装规范》等规定。采样之前必须致电相关实验室，确保遵循正确的样品提交程序，保证所送样品能在第一时间完成检测及储存。做好样品运输过程中的安全保障工作，避免在运输途中感染其他动物，避免样品被污染。运送的样品必须附有足够数量的冷却材料（如冰袋），以防变质。

采集好的样品应仔细进行包装，做好标记并送到实验室。样品应使用“三重包装系统”，保障运输过程中的生物安全，并避免样品受到污染。推荐样品使用“三重包装系统”，并正确标记，以防止泄漏，内附采样单。